Лаборатория альтернативных антимикробных биопрепаратов

В составе лаборатории функционирует Группа изучения биологической активности антимикробных пептидов

Лаборатория альтернативных антимикробных биопрепаратов создана для решения задач современной медицины, связанных с разработкой прототипов новых антибиотиков для персонализированной терапии внутрибольничных инфекций, вызываемых антибиотикорезистентными бактериями, на основе синтетических аналогов природных антимикробных пептидов с различным спектром антибактериальной активности, а также бактериофагов; оценка их эффективности и безопасности в экспериментах in vitro и in vivo.

Поиск средств борьбы с внутрибольничными инфекциями, вызываемыми мультирезистентными бактериями, является актуальной задачей экспериментальной и практической медицины. В качестве принципиально новых антибиотиков в настоящее время рассматриваются аналоги природных антимикробных пептидов (АМП) системы врожденного иммунитета вследствие затрудненного формирования резистентности микроорганизмов к этим соединениям и отсутствия негативного влияния на иммунную систему, свойственного некоторым конвенциональным антибиотикам. Для многих АМП показана способность предотвращать формирование биопленок бактериями, а также разрушать уже сформированные биопленки. Однако, учитывая, что большинство пептидов наряду с высокой антимикробной активностью проявляют и некоторые цитотоксические эффекты в отношении клеток человека, разрабатываются разнообразные структурные аналоги АМП с целью получения пептидных препаратов с оптимальными для практического применения свойствами. В рамках данного проекта планируется создание нескольких пептидных препаратов с разным спектром действия, а также выбор комбинаций АМП с применяемыми в медицине антибиотиками, при использовании которых будут наблюдаться эффекты синергического антимикробного действия в отношении определенных видов бактерий.

Другим перспективным направлением для борьбы с инфекциями, вызываемыми антибиотикорезистентными бактериями, является применение бактериофагов. В силу высокой избирательности бактерицидного действия  бактериофаги являются одним из наиболее эффективных средств персонализированной антибактериальной терапии.

 

Основные задачи:

  1. Разработка структурных аналогов природных АМП, имеющих разный спектр биологической активности их химический синтез;
  2. Оценка антимикробной активности пептидов в отношении антибиотикорезистентых клинических изолятов грамотрицательных и грамположительных бактерий (полученных из инфицированных ран, ротовой полости, мочеполового тракта) в отношении свободно плавающих (планктонных) бактерий и бактериальных биопленок – на моделях in vitro;
  3. Оценка безопасности наиболее активных пептидов для клеток человека в культуре, выбор пептидов, безопасных для исследуемых клеток;
  4. Изучение совместного действия пептидов с применяемыми в клинике антибиотиками и антисептиками, выявление синергических эффектов при использовании пептидов в комбинации с антимикробными соединениями различной природы в отношении антибиотико-устойчивых штаммов бактерий; выбор комбинаций, соединений, применение которых оптимально при инфицировании определенными видами бактерий.
  5. Оценка эффективности и безопасности полученных пептидов в экспериментальных моделях на лабораторных животных;
  6. Формирование коллекции (криобанка) бактериофагов грамположительных бактерий, циркулирующих в условиях стационаров и населяющих естественные биогеоценозы (водные и почвенные экосистемы Арктики и Антарктики)
  7. Изучение биологического разнообразия клинических и природных популяций фагов, активных в отношении возбудителей энтерококковых инфекций, оценка спектров их литической активности и структуры геномов
  8. Конструирование диагностических тест-систем на основе набора бактерифагов с целью оптимизации персонализированной фаговой терапии
  9. Отбор штаммов энтерококковых бактериофагов, наиболее перспективных для включения в комбинированные препараты для терапии инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи

 

Направления работы

  1. Разработка новых аналогов природных антимикробных пептидов: пролин-богатых пептидов беспозвоночных и млекопитающих (активных преимущественно в отношении грамотрицательных бактерий), пептидов со структурой бета-шпильки (широкий спектр антимикробной активности), проявляющих высокую антимикробную активность в отношении антибитикорезистентных клинических изолятов бактерий, на моделях in vitro и in vivo.
  2. Создание новых антибиотиков на основе бактериофагов, оценка их эффектов на бактерии, вызывающие внутрибольничные инфекции.

 

Описание проекта

Тематика проекта соответствует направлению «Инфекционные заболевания, микробная и антимикробная терапия»

На основе полученных ранее данных о высокой антимикробной активности ряда природных антимикробных пептидов, открытых авторами данного проекта, проведенного ими структурно-функционального анализа, а также с учетом данных литературы, будет разработан ряд структурных аналогов антибиотических пептидов.

Синтетические аналоги антимикробных пептидов будут получены с помощью твердофазного химического пептидного синтеза на приборе Symphony X (Protein Technologies, США).

Для оценки антимикробной активности пептидов будут использованы стандартные микробиологические методы, в частности, метод серийных разведений препаратов в жидкой питательной среде, содержащей микроорганизмы (метод в модификации Tossi et al., 1997); метод подсчета колоний, а также методы, основанные на применении витальных красителей (Alamar Blue и др.). Будет изучена антимикробная активность препаратов в отношении антибиотикоустойчивых клинических изолятов бактерий, полученных от пациентов с внутрибольничными инфекциями (инфицированные раневые поверхности, в том числе ожоговые, язвы и пр.): грамотрицательных бактерий (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii), и грамположительных бактерий (Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus mutans), определены минимальные ингибирующие и минимальные бактерицидные концентрации пептидов.

Подавление формирования бактериями биопленок является одной из наиболее актуальных задач современной медицины. Бактериальные биопленки образуются на различных поверхностях – на границах раздела фаз – и представляют собой сообщества прикрепленных к поверхности микроорганизмов, показатели метаболической активности которых и другие характеристики отличны от свойственных для одиночных клеток показателей. Основной особенностью микроорганизмов, существующих в составе биопленок, является их повышенная резистентность к антибиотическим препаратам, что обусловливает связанные с этим серьезные проблемы в медицинской практике, в особенности при использовании различных материалов медицинского назначения – катетеров, стентов, протезов и т.п.

Поэтому одной из задач проекта является не только характеристика антимикробной активности исследуемых пептидов в отношении одиночных (планктонных) бактерий, но и изучение влияния наиболее активных аналогов этих АМП на формирование биопленок. Для исследования эффектов пептидов на образование бактериальных биопленок будут проведены эксперименты с использованием видов бактерий, характерных для инфицированных ран, инфекций ротовой полости, кожи, слизистых мочеполовой системы. Бактерии будут культивироваться в присутствии или в отсутствии исследуемых пептидов в 96-луночных полистероловых планшетах с последующей окраской адгезировавших к поверхности полистерола и сформировавших биопленку бактерий красителем (кристаллическим фиолетовым) и дальнейшей количественной оценкой интенсивности сформировавшихся биопленок с помощью спектрофотометрического измерения оптической плотности спиртовых экстрактов связавшегося красителя при 570 нм на планшетном спектрофотометре.

Будут изучены эффекты сочетанного антибиотического действия исследуемых АМП с антибиотиками разных классов с целью выявления возможности повышения антибактериальной активности пептидов. Планируемая в рамках данного проекта работа направлена на выявление комбинаций АМП и антибиотиков (АБ), при применении которых будут многократно усиливаться антимикробные эффекты как АМП, так и АБ – в отношении антибиотикоустойчивых штаммов бактерий. Для определения комбинаций исследуемых веществ, имеющих синергичное действие в отношении микроорганизмов, будет использован метод серийных разведений в жидкой питательной среде, содержащей микроорганизмы, в сочетании с методикой «Шахматной доски» (“Checkerboard titration”).    Будет проведено изучение стабильности некоторых полученных аналогов АМП в присутствии сыворотки крови человека. Для этого пептиды будут инкубироваться в присутствии сыворотки крови (25%) в течение различных промежутков времени, после чего будет проведено хроматографическое разделение полученных образцов, масс-спектрометрический анализ пептидов, выходящих с хроматографической колонки и количественное определение интактных АМП. Измерения будут проводиться на масс-спектрометре MALDI TOF фирмы Bruker, имеющемся в ФГБНУ «ИЭМ».

Будет выполнено исследование возможной цитотоксической            активности пептидов в отношении клеток человека in vitro с использованием МТТ-теста, обработки красителем кристаллическим фиолетовым, применением различных витальных красителей – йодида пропидия, трипанового синего.

Для исследуемых структурных модификаций АМП будет рассчитано соотношение показателей антимикробной активности к показателям токсичности для клеток человека – в сравнении с соответствующими показателями, полученными для пептидов с нативной структурой (аналогично определению терапевтического индекса, отражающего соотношение дозы лекарственного средства, вызывающего терапевтический эффект, к дозе этого же лекарственного средства, при которой оно проявляет токсичность, в экспериментах in vivo), установлены особенности молекулы аналогов АМП, для которых наблюдается повышение величины данного соотношения.

Эффекты пептидов на заживление инфицированных ран (с использованием как индивидуальных видов бактерий, устойчивых к антибиотикам, так и смесей из нескольких видов микроорганизмов) будет проводится на модели полнослойной кожной раны у мышей.

Будет проведено исследование безопасности пептидов на модели in vivo.

Исследования  по разработке препаратов бактериофагов  будут включать в себя несколько этапов.

 

В течение первого этапа (2020-2021 годы) исследования будут сфокусированы на создании обширной коллекции бактериофагов грамположительных бактерий (энтерококков, стрептоккокков  и стафиллококков). Исследования 2021 -2022 годов  будут связаны с оценкой биологических свойств выделенных бактериофагов, оценкой их литического спектра и генетического разнообразия. Начиная с 2021 года  геномы  наиболее перспективных с точки зрения практического применения штаммов бактериофагов будут подвергаться секвенированию, а их последовательности – функциональному  аннотированию.

В качестве источников для выделения бактериофагов будет использовано две категории образцов биоматериала:

  1. образцы клинического материала от пациентов с внтурибольничной инфекцией в многопрофильных детских и взрослых стационарах г. Санкт-Петербурга
  2. образцы биоматериала, характеризующие водные и почвенные естественные биоценозы Арктики и Антарктики. Данные биологические образцы собраны участниками коллектива исполнителей в ходе серии экспедиций в Восточную Антарктиду, на архипелаг Шпицберген и архипелаг Новая Земля.  При определении перспективных для поиска  локализаций будет использован подход, включающий технологию концентрирования вирусных частиц методом химической флоккуляции [John, S. G., Mendez, C. B., Deng, L., Poulos, B., Kauffman, A. K. M., Kern, S., … & Sullivan, M. B. (2011). A simple and efficient method for concentration of ocean viruses by chemical flocculation. Environmental microbiology reports, 3(2), 195-202.] наряду с метагеномным секвенированием по протоколу Illumina HiSeq [Hayes, S., Mahony, J., Nauta, A., & Van Sinderen, D. (2017). Metagenomic approaches to assess bacteriophages in various environmental niches. Viruses, 9(6), 127.].

В качестве индикаторных культур при выделении бактериофагов будут использованы штаммы обширной коллекции эпидемических штаммов грамположительных бактерий, имеющейся в отделе молекулярной микробиологии ФГБНУ ИЭМ.

Способность выделенных изолятов к повышению вирулентности будет оценена  путем последовательных пассажей бактериофага на культуре соответствующего микроорганизма в жидкой питательной среде. Секвенирование фаговых геномов предполагается производить с использованием технологии Illumina на приборе MiSeq.

В результате проведенной работы будет разработано три прототипа пептидных препаратов, отличающихся спектром антимикробной активности, и препарат для фаготерапии  энтерококковой инфекции, обусловленной ванкомицин-резистентными штаммами энтерококков, включающий набор из 10 и более различных штаммов бактериофагов.

В рамках данного проекта планируется международное сотрудничество с ведущими зарубежными учеными, работающими в области изучения антимикробных пептидов или бактериофагов (лаборатория проф. Алессандро Тосси (Университет г. Триеста), научная группа  Альберто Витали (Лаборатория пептидомики и биологически активных пептидов CNR-SCITEC Институт химических наук и технологий/Институт биохимии и клинической биохимии/Католический университет, Рим-Милан), лаборатория проф. Ральфа Хоффмана (Лейпцигский университет) и др.). В распоряжении коллектива авторов имеется современное оборудование, с использованием которого представляется возможным проводить работу на мировом уровне. Соответствие работ мировому уровню подтверждается наличием у участников проекта публикаций в рейтинговых зарубежных журналах, в том числе и совместные статьи с зарубежными учеными.

Реализация данного проекта в перспективе позволит сократить экономические затраты общественного здравоохранения за счет снижения смертности от инфекционных болезней. В ближайшей перспективе планируется создание антибиотических препаратов на основе синтетических аналогов природных антимикробных пептидов и препаратов бактериофагов для местного применения (для обработки раневых поверхностей, инфицированных язв, различных изделий медицинского назначения). В отдаленных перспективах спектр применения этих препаратов может быть расширен.

Применение таких препаратов будет целесообразным в случае неэффективности применения стандартных схем химиотерапии, будет основываться на персонифицированных подходах и позволит решить ряд проблем, связанных с тяжелыми нозокомиальными инфекциями, вызываемыми антибиотикорезистентными бактериями.

Руководитель  д.б.н., член-корреспондент РАН, Шамова Ольга Валерьевна

Сотрудники

Жаркова Мария Сергеевна – к.б.н., старший научный сотрудник

Комлев Алексей Сергеевич – младший научный сотрудник

Сухарева Мария Сергеевна – младший научный сотрудник

Владимирова Елизавета Васильевна – младший научный сотрудник

Протасов Евгений Александрович – ведущий инженер

 

Основные публикации сотрудников:

  • P.M. Kopeikin, M.S. Zharkova, A.A. Kolobov, M.P. Smirnova, M.S. Sukhareva, E.S. Umnyakova, V.N. Kokryakov, D.S. Orlov, B.L. Milman, S.V. Balandin, P.V. Panteleev, T.V. Ovchinnikova, A.S. Komlev, A.Tossi, O.V. Shamova. Caprine bactenecins as promising tools for developing new antimicrobial and antitumor drugs. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2020. Q2 – WoS, Q1 – SJR (Impact Factor 4.1) doi: 10.3389/fcimb.2020.552905

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcimb.2020.552905/abstract

  • E. Eliseev, I. N. Terterov, A. N. Yudenko, O. V. Shamova. Linking sequence patterns and functionality of alpha-helical antimicrobial peptides // Bioinformatics, – 2019. – Vol. 15 (16). – P. 2713-2717. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bty1048  (Impact factor 5.481, Q1)
  • Golubeva O.Y., Brazovskaya E.Y., Shamova O.V. Biological activity and sorption ability of synthetic montmorillonite modified by silver/lysozyme nanoparticles // Applied Clay Science. 2018. Т. 163. С. 56-62 DOI: 10.1016/j.clay.2018.07.015 (Impact Factor: 3.35, Q1).          http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1387181116000081
  • Müller A., Grein F., Schneider T., Sahl H.-G., Otto A., Becher D., Gries K., Orlov D., Shamova O., Zarubaev V., Girard M., François P., Sher X., Roemer T. Differential daptomycin resistance development in Staphylococcus aureus strains with active and mutated gra regulatory systems // International Journal of Medical Microbiology. 2018. Т. 308. № 3. С. 335-348. DOI: 10.1016/j.ijmm.2017.12.002 (Impact factor 3.3, Q2 – WoS, Q1 – SJR) https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1438422117303958
  • Smirnova MP, Kolodkin NI, Kolobov AA,  Afonin V.G; Afonina IV; Stefanenko LI;  Shpen’ VM; ;  Shamova OV.,  Kolobov A A. Indolicidin analogs with broad-spectrum antimicrobial activity and low hemolytic activity. Peptides. 2020; 132:170356. doi:10.1016/j.peptides.2020.170356 Q2 Web of Science, SJR.
  • Orlov D.S., Shamova O.V., Eliseev I.E., Zharkova M.S., Chakchir O.B., Antcheva N., Zachariev S., Panteleev P.V., Kokryakov V.N., Ovchinnikova T.V., Tossi A. Redesigning arenicin-1, an antimicrobial peptide from the marine polychaeta Arenicola marina, by strand rearrangement or branching, substitution of specific residues, and backbone linearization or cyclization. Marine Drugs. 2019 Jun 23;17(6). pii: E376. doi: 10.3390/md17060376. https://www.mdpi.com/1660-3397/17/6/376  Q2 Web of Science, SJR
  • S. Zharkova, D.S. Orlov, O.Yu. Golubeva, O.B. Chakchir, I.E. Eliseev, T.M. Grinchuk, O.V. Shamova. Application of antimicrobial peptides of the innate immune system in combination with conventional antibiotics – a novel way to combat antibiotic resistance? // Front. Cell. Infect. Microbiol. – 30 April 2019. https://doi.org/10.3389/fcimb.2019.00128  Q2 – WoS, Q1 – SJR (Impact Factor 4/1) Web of Science.
  • Panteleev P.V., Bolosov I. A., Kalashnikov A. A., Kokryakov V. N., Shamova O. V.,  Emelianova A.A., Balandin S.V., Ovchinnikova T.V. Combined antibacterial effects of goat cathelicidins with different mechanisms of action // Front. Microbiol., Vol. 9, Article 2983, P. 1-19.     DOI: 10.3389/fmicb.2018.02983, (Impact Factor 4.019,  Q2 – WoS, Q1 – SJR), https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2018.02983/full
  • Umnyakova E.S., Zharkova M.S., Berlov M.N., Shamova O.V., Kokryakov V.N.. Human antimicrobial peptides in autoimmunity . Autoimmunity. 2020. Т. 53. № 3. С. 137-147 doi:10.1080/08916934.2020.1711517 Q3 Web of Science, SJR.
  • N. Chernov, D. A. Alaverdian, O. S. Glotov, M. V. Talabaev, S.P. Urazov, S. G. Shcherbak, A. Renieri, E. Frullanti, O. Shamova Related expression of TRKA and P75 receptors and the changing copy number of MYC-oncogenes determine the sensitivity of brain tumor cells to the treatment of the nerve growth factor in combination with cisplatin and temozolomide . Drug Metabol Pers Ther 2020. https://doi.org/10.1515/dmpt-2020-0109 published online. Q3 Web of Science, Q2 – SJR.
  • Yu. Ulyanova, L. N. Kurylenko, O. V. Shamovа, D. S. Orlov, O. Yu. Golubeva. Hemolitic Activity and Sorption Ability of Beta Zeolite Nanoparticles // Glass Physics and Chemistry, 2020, Vol. 46, No. 2, pp. 155–161). Scopus, WoS, Q4.
  • Golubeva O.Y., Ulyanova N.Y., Zharkova M.S., Shamova O.V. Synthesis and study of zeolites modified by silver nanoparticles and clusters: biological activity // Glass Physics and Chemistry. – 2018. – Т. 44, № 6. – С. 586-590). DOI 10.1134/S108765961806007X    Scopus, WoS Q4
  • Golubeva O.Yu., Golubkov V.V., Yukhnev V.A., O.V. Shamova. Synthesis of silver nanoparticles modified with lysozyme and sodium dioctyl sulfosuccinate and comparison of their biological activities // Glass. Phys. Chem. 2017.V.43. N 1. P. 63-69. Scopus, Web of Science. Q4    DOI 10.1134/S1087659617010060

 

Патенты и изобретения

  1. Елисеев И.Е., Тертеров И.Н., Шамова О.В. Синтетический пептид лексицин-1, обладающий антимикробным действием Патент на изобретение RU 2715854 C1, 03.03.2020. Заявка № 2019120356 от 28.06.2019.
  2. Пантелеев П.В., Емельянова А.А., Болосов И.А., Баландин С.В., Шамова О.В., Кокряков В.Н., Овчинникова Т.В. Пептид, проявляющий антибактериальные и противоопухолевые свойства. Патент на изобретение RU 2702661 C1, 09.10.2019. Заявка № 2019116012 от 24.05.2019.
  3. Пантелеев П.В., Баландин С.В., Болосов И.А., Емельянова А.А., Кокряков В.Н., Шамова О.В., Овчинникова Т.В. Пептид, обладающий противоопухолевой активностью Патент на изобретение RU 2658781 C1, 22.06.2018. Заявка № 2017146644 от 28.12.2017.
  4. Баландин С.В., Болосов И.А., Пантелеев П.В., Кокряков В.Н., Шамова О.В., Овчинникова Т.В. Плазмидный вектор PET-MCHBAC75NA, штамм бактерии Еschrichia coli BL21(DE3/ PET-MCHBAC75NA для экспрессии антимикробного пептида минибактенецина CHBAC7.5 Nα и способ получения указанного пептида Патент на изобретение RU 2618850, 11.05.2017. Заявка № 2016123389 от 14.06.2016.